Фармакогенетические маркеры CYP как предикторы эффективности ЭКО при ановуляторном бесплодии

Введение

Ановуляторное бесплодие является одной из наиболее распространённых эндокринных причин нарушения женской репродуктивной функции. При неэффективности консервативной гормональной терапии методом выбора становится экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) с контролируемой овариальной стимуляцией (КОС). Согласно современным данным, эффективность ЭКО широко различается в каждом конкретном случае, и значительная часть обследуемых пациенток не достигают клинической беременности даже при использовании стандартизированных протоколов стимуляции [1, 2]. Одним из перспективных направлений персонализированной медицины является поиск генетических маркёров, ассоциированных с ответом на терапию [3-5]. Особый интерес представляют гены семейства цитохрома P450 (CYP), кодирующие ферменты, участвующие в метаболизме экзогенных и эндогенных субстратов, включая половые стероиды и препараты, применяемые в протоколах ЭКО [6-8]. Показано, что полиморфизмы генов CYP могут влиять на индивидуальную фармакокинетику гонадотропинов, а также на эндогенный гормональный фон, в совокупности определяя эффективность овариальной стимуляции и вероятность наступления беременности [3, 9-11].

С позиции репродуктивной медицины особую значимость имеют изоферменты CYP3A4 и CYP3A5, участвующие в биотрансформации прогестинов, а также CYP2D6, CYP2C9 и CYP2C19 дополнительно вовлеченные в данный процесс [12-14]. CYP2A6 — стероид-чувствительный ген, его активность модулируется эстрогеном и прогестероном [15, 16]. В то же время данные о роли генов данных изоферментов CYP в прогнозировании исходов ЭКО остаются фрагментарными и требуют дальнейшего изучения.

Цель исследования

Оценка связи полиморфных вариантов генов CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5 с наступлением клинической беременности в программах ЭКО у пациенток с ановуляторным бесплодием.

Материалы и методы

Работа выполнена в рамках проспективного пилотного когортного исследования, проведённого на базе отделения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) Перинатального центра ГБУЗ Республики Мордовия «МРЦКБ» в период с мая 2023 по январь 2025 года. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева» (протокол №116 от 12.05.2023). Все участницы подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Первичный скрининг проведён среди 265 пациенток с верифицированным диагнозом ановуляторного бесплодия (МКБ-10: N97.0), в дальнейшем, после применения критериев включения и исключения в финальную аналитическую выборку вошли 96 пациенток.

Критерии включения: возраст 25-35 лет; документально подтверждённое бесплодие, обусловленное отсутствием овуляции, верифицированное на основании клинических и лабораторных данных; нормальный овариальный резерв; отсутствие патологии эндометрия по данным ультразвукового исследования и гистероскопии; нормальный кариотип у обоих партнёров; перенос эмбрионов степени 3-6 с качеством внутренней клеточной массы и трофоэктодермы не ниже A/B по шкале Gardner.

Критерии исключения: мужской фактор бесплодия; индекс массы тела >30 кг/м²; экстрагенитальная или генитальная патология, служащая абсолютным противопоказанием к ЭКО; курение; добровольный отказ пациентки от участия на любом этапе исследования.

Средний возраст участниц составил 30,5±2,5 года; все пациентки относились к европеоидной расе. Все участницы прошли стандартизированную программу ЭКО с использованием собственных ооцитов. Овариальная стимуляция проводилась по короткому протоколу с применением антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона: ганиреликс или цетрореликс в дозе 0,25 мг/сут подкожно. В качестве гонадотропного агента использовали рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) — фоллитропин альфа в стартовой дозе 100-150 МЕ/сут подкожно с последующей индивидуальной коррекцией дозы в зависимости от динамики фолликулогенеза. Триггером финального созревания ооцитов служил хориогонадотропин альфа в дозе 250 мкг подкожно. Ведение пациентов осуществлялось в соответствии с действующими Национальными клиническими рекомендациями по лечению женского бесплодия и применению вспомогательных репродуктивных технологий.

При формировании групп исследования, конечным показателем служил факт наступления клинической беременности, определяемой как эхографическая визуализация плодного яйца на 21-е сутки после переноса эмбрионов. В соответствии с исходом цикла ЭКО все пациентки были распределены на две группы: 1 группа (основная, n=48) — пациентки, у которых клиническая беременность наступила с первой попытки ЭКО; 2 группа (сравнения, n=48) — пациентки с тремя и более безрезультатными циклами ЭКО в анамнезе.

Забор венозной крови (6 мл) осуществляли натощак из кубитальной вены в день включения пациентки в протокол ЭКО. Сбор биоматериала производили в одноразовые стерильные вакуумные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА. До момента экстракции образцы хранили при температуре -20 °C; долгосрочное хранение осуществляли при -70 °C. Выделение геномной ДНК проводили с использованием магнитосорбентных реагентов («Genotek», Россия) на автоматизированной платформе Allsheng Auto-Pure 96 (Китай) в соответствии с протоколом производителя. Генотипирование выполняли методом полногеномного типирования на биочипах Infinium Global Screening Array-24 v3.0 («Illumina», США) с применением сканирующей системы iScan согласно протоколу Infinium HTS Assay [17]. В настоящей работе представлены результаты анализа полиморфизмов генов семейства CYP, включённых в панель генотипирования: CYP2A6 (rs1809810, rs7259706, rs7260629, rs8192733, rs12459249, rs28399433, rs56113850, rs57897628, rs113288603), CYP2C9 (rs1057910, rs1799853), CYP2C19 (rs4244285, rs4986893, rs12248560), CYP2D6 (rs1065852, rs3892097, rs35742686), CYP3A4 (rs35599367), CYP3A5 (rs776746).

Статистическую обработку данных проводилась с использованием пакета Statistica 12.5 (StatSoft, USA). Проверку соответствия количественных переменных нормальному закону распределения выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка; данные представлены в формате M±SD. Для межгрупповых сравнений количественных признаков применяли t-критерий Стьюдента. Сравнение частот генотипов и аллелей между группами осуществляли с использованием критерия χ² Пирсона. В случаях, когда ожидаемое число наблюдений в одной из ячеек таблицы сопряжённости составляло менее 5, использовался точный критерий Фишера. Соответствие наблюдаемых частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга (HWE) оценивали в группе сравнения методом χ². Силу ассоциации полиморфных вариантов с исходом ЭКО выражали через отношение шансов (odds ratio, OR) с расчётом 95% доверительного интервала (95% CI). Порогом статистической значимости принято значение p <0,05. Также, учитывая ограниченный объем выборки (n=96) для дополнительной верификации выявленных ассоциаций применяли пермутационный тест (процедура Монте-Карло с 10 000 перестановок фенотипических меток при фиксированной генотипической структуре). Данный метод позволяет получить эмпирическую оценку уровня значимости (p-perm), не зависящую от предположений о нормальности распределения, и является «золотым стандартом» непараметрической проверки гипотез в генетических исследованиях. Результат считался статистически значимым при эмпирическом уровне значимости p-perm <0,05. Пермутационный тест применяли только для генотипов, которые продемонстрировали статистически значимые ассоциации при стандартном расчёте.

Результаты

В результате проведённого анализа из 6 изученных генов CYP выявлены статистически значимые ассоциации для генов CYP2A6, CYP2C19 с эффективностью ЭКО (табл. 1).

Наиболее выраженные ассоциации зафиксированы для полиморфизмов гена CYP2A6. Так, для локуса rs8192733 распределение генотипов между группами характеризовалось крайне высокими различиями, генотип G/G встречался преимущественно в группе с неудачными попытками ЭКО (33 из 48 против 7 из 48 в основной группе), что соответствовало OR=0,105 (95% CI 0,105-0,316; p <0,001) (табл. 1). Гетерозиготный генотип C/G и гомозиготный генотип С/С показали значимое преобладание в основной группе и были ассоциированы с эффективной процедурой ЭКО (OR=3,176; 95% CI 1,202-8,395; p=0,031 и OR=4,795; 95% CI 1,212-18,963; p <0,001 соответственно). Полиморфизм rs56113850 гена CYP2A6 также показал статистически значимые межгрупповые различия. Согласно данным проведенного анализа, генотип C/T ассоциировался с 3,1-кратным повышенным шансом наступления беременности (OR=3,095; 95% CI 1,284-7,458; p=0,010), тогда как гомозиготный вариант T/T, напротив, чаще встречался в группе сравнения и был ассоциирован с неблагоприятным исходом (OR=0,286; 95% CI 0,100-0,812; p=0,015) (табл. 1). Для полиморфизма rs57897628 гена CYP2A6 показано, что носительство генотипа A/A ассоциировалось с более низкой вероятностью наступления беременности (OR=0,256; 95% CI 0,091-0,725; p=0,005), а гетерозиготный генотип A/G и гомозиготный G/G не достигали статистической значимости (p >0,05) (табл. 1). Остальные исследованные полиморфизмы этого же гена (rs1809810, rs7259706, rs7260629, rs12459249, rs28399433, rs113288603) не продемонстрировали статистически значимых ассоциаций с исходом ЭКО.

Согласно полученным результатам, для гена CYP2C19 значимая ассоциация выявлена для полиморфизма rs4244285. Генотип G/G значительно чаще встречался в группе сравнения (45 из 48 против 32 из 48 в основной группе), и был ассоциирован с неблагоприятной процедурой (OR=0,133; 95% CI 0,036-0,496; p=0,001), гетерозиготный генотип G/A, напротив, преобладал в группе с наступившей беременностью и был ассоциирован с 7,5-кратным шансом наступления беременности (OR=7,5; 95% CI 2,016-27,901; p=0,001), при этом полиморфизмы rs4986893 и rs12248560 гена CYP2C19 не показали статистически значимых различий между группами (p <0,05) (табл. 1).

Следует отметить, что для генов CYP2C9, CYP2D6, CYP3A4 и CYP3A5 не выявлено статистически значимых различий в распределении генотипов между группами. Также, в ряде случаев (rs1057910, rs1799853, rs35742686, rs700519) отдельные генотипы встречались исключительно в одной из групп, что не позволило рассчитать отношение шансов и достичь статистической значимости (табл. 1).

Обсуждение

В представленном пилотном исследовании впервые проведен комплексный анализ ассоциаций полиморфизмов шести генов семейства цитохрома P450 (CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5) с исходом ЭКО у пациенток с ановуляторным бесплодием. Согласно полученным данным выявлены статистически значимые ассоциации для полиморфизмов CYP2A6 (rs8192733, rs56113850, rs57897628) и CYP2C19 (rs4244285).

Для rs8192733 ассоциации зафиксированы для генотипа G/G гена CYP2A6 с неэффективным циклом ЭКО (p <0,001) и С/С, С/G с эффективной процедурой (p=0,031 и p=0,031 соответственно). Согласно современным исследованиям, ген CYP2A6 кодирует фермент, который участвует в метаболизме ксенобиотиков и эндогенных субстратов, включая стероидные гормоны [18, 19]. Полиморфизм rs8192733, локализованный в интронной области гена, может влиять на эффективность сплайсинга и уровень экспрессии фермента, что в свою очередь оказывает влияние на метаболизм эндогенных стероидов и препаратов, используемых в протоколах КОС [18, 19]. В исследовании по изучению влияния полиморфизма CYP2A6 rs8192733 на эффективность летрозола у женщин с бесплодием на фоне СПКЯ не было выявлено статистически значимых ассоциаций, что может быть связано с особенностями популяции и различиями в дизайне исследований [20].

В проведённом исследовании для полиморфизма rs4244285 гена CYP2C19 выявлена ассоциация для генотипа G/A с 7,5-кратным шансом наступления беременности (p=0,001), в то время как для генотипа G/G с неблагоприятным исходом (p=0,001). Показано, что полиморфизмы CYP2C19 могут влиять на метаболизм прогестерона [20]. Среди носителей фенотипа промежуточного метаболизма по CYP2C19 отмечались статистически значимо более высокие AUC и C_max прогестерона по сравнению с носителями нормального (экстенсивного) фенотипа, при этом ассоциаций с полиморфизмами CYP2C9 выявлено не было, исходя из чего можно предположить, что CYP2C19 может вносить больший вклад в метаболизм прогестерона, чем CYP2C9 [22]. Согласно современным исследованиям, относительно изученным функциональным вариантом, ассоциированным с фенотипом «медленного метаболизма», является полиморфизм rs4244285 гена CYP2C19 (G/A) [20-22]. В представленном исследовании генотип G/G, соответствующий нормальному метаболизму, значительно чаще встречался в группе с неудачными попытками ЭКО. Исходя из этого факта, можно предположить, что пациенткам — носителям генотипа G/G CYP2C19 требуется более высокая доза прогестинов для поддержки лютеиновой фазы, что при использовании стандартизированных протоколов может приводить к субоптимальному ответу.

Отсутствие в представленном исследовании значимых ассоциаций для генов CYP2C9, CYP2D6, CYP3A4 и CYP3A5 не исключает их потенциальной роли в прогнозировании исходов ЭКО. Для дальнейшего изучения вопроса их роли в прогнозировании исходов ЭКО необходимо увеличить объём выборки, что также позволит выявить менее заметные ассоциации. Кроме того, нельзя исключить, что влияние этих генов может проявляться не на этапе наступления беременности, а на других этапах репродуктивного процесса, таких как качество ооцитов или эмбрионов. Наряду с этим следует отметить, что в настоящем исследовании пермутационный тест применялся только для генотипов, показавших значимые ассоциации при стандартном расчёте. Такой подход позволил минимизировать риск ложноположительных результатов при множественном тестировании, сохранив при этом статистическую мощность для подтверждения выявленных ассоциаций, за счёт чего все значимые ассоциации были подтверждены пермутационным тестом (p-perm <0,05), что повышает достоверность полученных результатов.

Ограничения исследования

Среди ограничений данного исследования можно выделить небольшой объём выборки (n=96), что характерно для пилотных работ, а также отсутствие валидационной когорты. Кроме того, исследование проводилось на пациентках исключительно европеоидной расы, что ограничивает возможность экстраполяции результатов на другие популяции, а также не оценивался совместный вклад нескольких полиморфизмов (гаплотипический анализ), что может в перспективе стать предметом дальнейших исследований.

Заключение

Результаты проведённого пилотного исследования показали наличие связи между полиморфными вариантами генов CYP2A6 (rs8192733, rs56113850, rs57897628), CYP2C19 (rs4244285) и вероятностью наступления клинической беременности в программах ЭКО у пациенток с ановуляторным бесплодием. В целом, полученные данные согласуются с результатами более ранних исследований и подтверждают значимую роль полиморфизмов генов CYP в индивидуальных различиях ответа на терапию. Также полученные данные открывают перспективы для разработки персонализированных подходов к ведению пациенток с ановуляторным бесплодием, основанных на фармакогенетическом тестировании. Для подтверждения полученных результатов и более глубокой оценки их клинической значимости необходимы дальнейшие исследования на более крупных выборках с включением валидационных когорт и многофакторного анализа.